撰文
咸姐
多发性硬化症（MS）是一种中枢神经系统（CNS）炎症性脱髓鞘疾病，大多数患者会出现慢性进行性行动能力丧失。大多数患者在确诊后15年内失业，与健康人群相比，他们的抑郁症患病率、自杀率和离婚率均显著增加。有一半的患者在确诊后20年内需要行动方面的辅助，50%的患者最终出现严重的认知障碍。MS是一种病因不明的异质性自身免疫性疾病，其自身反应性淋巴细胞攻击CNS的髓鞘。大量有力的证据表明，免疫基因多态性与MS易感性之间存在密切关联。从MS的研究历史上看，MS与炎性辅助性T细胞（TH）相关，T细胞在脱髓鞘疾病的过继转移模型中发挥着关键作用；因此，MS研究的重点一直聚焦于T细胞。然而，越来越多的证据表明，尤其是在过去的10-15年里，B细胞参与了MS的发病机制。研究发现，MS患者脑脊液（CSF）中的B淋巴细胞可引起炎症并分泌寡克隆免疫球蛋白，此外，一些被批准的治疗MS的最有效的方法是靶向B细胞的，这些都强调了B细胞在MS病理生物学中的重要性，然而，B细胞在疾病发展中的确切作用仍不清楚。与此同时，研究发现抗流行性腮腺炎、麻疹、水痘带状疱疹和EB病*（EBV）的抗病*抗体常出现在MS中，但它们之间的相关性尚不清楚。从流行病学角度来看，EBV感染与MS有关，EBV感染期间的症状性传染性单核细胞增多症增加了MS的风险，并且与健康个体相比，靶向EBV核抗原1（EBNA1）区域（包括AA-区域）的抗体反应在MS中更强，但其具体病理作用尚不清楚。年1月24日，来自美国斯坦福大学医学院的WilliamH.Robinson团队在Nature上在线发表题为ClonallyExpandedBCellsinMultipleSclerosisBindEBVEBNA1andGlialCAM的文章，通过对MS血液和配对的CSF中的B细胞库进行单细胞测序，然后基于蛋白质微阵列检测针对MS相关病*的重组表达的CSF来源的抗体，初步鉴定出一种交叉反应性CSF来源的抗体，证明了EBV转录因子EBNA1与CNS蛋白GlialCAM之间的高亲和力分子拟态，并为其相关性提供了晶体结构和体内功能证据，详细描述了这种拟态在MS病理生理学中的潜在意义，从而为MS和EBV之间的关联提供了一个新的机制联系，并可用于指导新型MS疗法的开发。值得一提的是，就在该文章在线10天前，Science杂志也发表了相关的研究成果，详见此前BioArt的报道：Science大量纵向样本揭示EB病*感染与多发性硬化症的关联性本文研究人员收集了发病期或复发缓解型MS急性发作期的MS患者的CSF和血液样本，用流式细胞仪对单个B细胞进行分类，观察到血液和CSF中B细胞的特征性表型差异，包括（1）与血液相比，CSF中的高浆细胞（PB）数，（2）与非PBB细胞相比，PB中整合素-α4和HLA-DR的差异表达以及（3）CSF的PB中免疫球蛋白（IgG）的高丰度。进一步地通过流式细胞术从血液中分离PB以及从配对的CSF中分离B细胞，并对其全长配对的重链（HC）和轻链（LC）VDJ区域进行测序。结果显示CSF基因库是高度克隆的，表明CSF中含有选择性克隆的抗原特异性增殖，且倾向于使用五种免疫球蛋白HC-V（IGHV）基因，而3名神经炎性疾病的非MS对照患者的CSF库则并未表现出如此广泛的克隆性和高IgG使用率。MS患者的CSF中的免疫球蛋白水平升高，少数高丰度的寡克隆区带（OCB）的存在是MS的标志。为了确定克隆的PB是否是鞘内免疫球蛋白的来源，研究人员从CSF中分离出免疫球蛋白，通过质谱对其进行表征，并与相应的抗体库数据集进行比较，结果表明克隆扩增的PB是CSFOCB的主要来源。本研究从MS的CSF中获得了个以单克隆抗体（mAb）形式表达的B细胞抗原受体（BCR）序列，每个序列代表一个克隆扩增。在含有不同病*裂解物的蛋白微阵列上探测mAb的抗病*反应性发现，有1/3表达的mAb与EBV蛋白和肽结合，约20%的mAb与其他病*结合。有趣的是，研究人员在9例MS患者中发现了来自6例患者的mAb可以与EBV转录因子EBNA1结合，来自8例患者的mAb可以与EBNA1肽结合。进一步实验证实mAbMS39p2w可以与EBNA1的MS相关区域AA-结合，而富含脯氨酸/精氨酸的区域AA-是MS39p2w的中心表位。同时，研究人员以2.5?的分辨率解析了EBNA1AA-与MS39p2w-Fab的复合物的晶体结构（图1）。图1随后，研究人员在HuProt微阵列（包含超过个蛋白质，占人类蛋白质组的80%）上探测了mAbMS39p2w，发现其可以与胶质细胞粘附分子（GlialCAM，一种通过星形胶质细胞和少突胶质细胞表达于CNS的免疫球蛋白超家族细胞粘附分子）结合。与此同时，研究人员发现虽然MS39p2w及其未突变的种系祖先具有与EBNA1结合的相似的亲和力，但是MS39p2w的超高体细胞突变（SHM）将其与CNS模拟GlialCAM的亲和力提高了一个数量级。而GlialCAM的翻译后磷酸化促进了抗EBNA1MS39p2w与GlialCAM发生交叉反应。那么上述MS39p2w抗GlialCAM的反应性是否代表了MS中更广泛的现象呢？研究人员测试了剩余的个克隆的MSmAb对GlialCAM蛋白和跨越GlialCAMAA-的多肽的反应性，结果发现MAPB可产生针对多个GlialCAM表位的抗体。研究还发现，实验涉及的所有MS患者和大多数健康人的血浆都对EBNA1蛋白表现出反应性，而在三批独立患者队列中均证实，MS患者对EBNA1AA-和GlialCAM的反应性显著增加。所有结果均证实，本研究中发现的分子拟态在MS患者中很普遍。最后，为了评估抗EBNA1AA-免疫反应对神经炎症的影响，研究人员利用了实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE），即MS的小鼠模型。实验结果显示，在EBNA1AA-免疫后产生了抗GlialCAM抗体，此外，用EBNA1AA-和PLPAA-联合免疫小鼠可增强CNS免疫细胞浸润和脱髓鞘（人类MS病理学的两个主要特征）。而除了抗GlialCAM抗体滴度外，人类T细胞数据表明CD8+T细胞也在抗GlialCAM的免疫反应中起着重要作用。综上所述，通过利用成对链BCR库测序、克隆抗体序列的合理选择和三个独立的高通量蛋白质组学平台，本研究从MS患者的CSF中鉴定出一种单克隆抗体，该抗体以高亲和力结合MS相关表位EBNA1AA-，并与GlialCAM发生交叉反应。同时证明了在大约20-25%的MS患者中存在交叉反应性EBVEBNA1和GlialCAM抗体，并表明用该EBNA1表位联合免疫小鼠会加剧自身免疫性脱髓鞘。由此不仅绘制了MS患者CSF和血液中B细胞库的详细蓝图，而且揭示了EBV感染与MS病理生物学之间的机械联系。原文链接：